Dalam game ini kita akan berperan sebagai : Ezio Auditore da Firenze, Altaïr ibn La-Ahad dan Desmond Miles. Kita akan di bawa mengembara di kota Constantinople yang terdiri dari empat distik yaitu Constantin, Beyazid, Imperial, dan Galata, pada tahun 1511 pada masa kebangkitan kekuasaan Ottoman. Kita diharuskan mengikuti jejak mentor legendarisnya, Altair, untuk menemukan senjata yang dapat menghentikan peperangan Templar dan assassin selamanya, yang telah di segel oleh Altair menggunakan empat kunci. Dalam perjalanan ini kita akan menemui beberapa karakter penguasa berpengaruh pada jaman itu, seperti Manuel Palailogos, seorang penguasa di Lost Byzantine, Prince Suleiman dan pamannya Prince Ahmet, salah seorang yang akan menjadi Sultan terbesar di jaman kekuasaan Ottoman
Setelah dengan terpaksa membunuh kekasihnya Lucy Stillman, Desmond menderita koma, dan masuk kembali ke dalam animus untuk mempertahankan kesadarannya, dimana dia jatuh ke Animus backdoor yang di sebut Black Room, Desmond berharap disini dia bisa menata ulang pikirannya dan bangun dari koma dengan menempatkan hubungan antara ingatan akan dirinya sendiri, Altaïr Ibn-La'Ahad dan Ezio Auditore da Firenze secara bersama-sama.
